La
química de la herencia
El
DNA fue aislado por primera vez en 1869 por Friedrich Miescher. Luego
se aislaron los distintos tipos de bases nitrogenadas que conforman
el DNA y se demostró que el cromosoma eucarionte contenía DNA y
proteínas en cantidades aproximadamente iguales. La complejidad de
las proteínas llevó a pensar que ellas eran los genes.
La
pista del DNA
El
DNA es una molécula con forma de hélice que contiene la información
genética de los seres vivos. Está formado por cuatro nucleótidos,
compuestos por una base nitrogenada, un azúcar de desoxirribosa y un
grupo fosfato. Los nucleótidos están constituidos por dos clases de
bases nitrogenadas: las purinas adenina (A) y guanina (G), y las
pirimidinas citosina (C) y timina (T). Entre los individuos de una
misma especie, el DNA tiene igual proporción de A que de T, e igual
proporción de G que de C. Todo esto se sabía a comienzos de la
década de 1950.
El
modelo de Watson y Crick
En
1953, usando la información disponible, James Watson y Francis Crick
construyeron el modelo de estructura del DNA que se considera el más
explicativo en la actualidad.
En
el modelo de Watson y Crick, la molécula de DNA es una doble hélice
formada por dos cadenas de nucleótidos apareadas. En cada cadena,
los nucleótidos se pueden acoplar en cualquier orden o secuencia.
Además, las adeninas de una cadena sólo se pueden aparear con
timinas de la otra, las guaninas sólo con citosinas, y viceversa en
ambos casos. El apareamiento se mantiene estable mediante puentes de
hidrógeno entre los nucleótidos enfrentados. Las cadenas tienen
dirección, pues los grupos fosfato forman un puente entre el quinto
carbono del azúcar de un nucleótido y el tercer carbono del azúcar
del siguiente, que determina un extremo 3' y otro 5'. Las dos cadenas
apareadas corren en direcciones opuestas (son antiparalelas).
El
armazón de la hélice está compuesto por las unidades
azúcar-fosfato de los nucleótidos. Los peldaños están formados
por bases nitrogenadas, las purinas adenina y guanina -con una
estructura de anillo doble- y las pirimidinas timina y citosina más
pequeñas, con su estructura de anillo simple. Cada peldaño está
formado por dos bases, una purina enfrentada a una pirimidina. Dos
purinas combinadas tendrían más de 2 nanómetros y dos pirimidinas
no alcanzarían para cubrir esta distancia. Pero una purina apareada
en cada peldaño con una pirimidina mantienen un diámetro constante
de 2 nanómetros en toda la longitud de la molécula.
El
mecanismo de replicación del DNA
La
replicación del DNA es semiconservativa: la doble hélice se abre y
cada cadena sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena. Así
se producen dos réplicas exactas de la molécula original.
La
replicación comienza en una secuencia específica de nucleótidos
llamada origen de la replicación. Los cromosomas procariontes tienen
un solo origen de replicación; los eucariontes, varios.
En
la replicación intervienen proteínas iniciadoras y enzimas que
separan las dos cadenas de DNA. Las cadenas nuevas son sintetizadas
por la DNA polimerasa III, que para comenzar su actividad requiere la
presencia de un cebador (segmento de RNA sobre el cual inicia la
síntesis). Al separarse las dos cadenas originales, se forman dos
estructuras en forma de Y, llamadas horquillas de replicación. La
replicación avanza en forma bidireccional, porque la síntesis y las
dos horquillas de replicación se producen en direcciones opuestas
desde un único origen.
La
cadena 5' a 3' se sintetiza en forma continua como una sola unidad y
se denomina adelantada; la cadena 3' a 5' se sintetiza de manera
discontinua, como una serie de fragmentos llamados de Okazaki y se
llama cadena retrasada. Cada fragmento de Okazaki es sintetizado en
la dirección 5' a 3' y requiere un cebador. Luego, el RNA del
cebador es reemplazado por DNA y la enzima ligasa une todos los
fragmentos.
Las
dos cadenas de la doble hélice de DNA se separan y sirven como
moldes para la síntesis de nuevas cadenas complementarias. Las
helicasas, enzimas que operan en las horquillas de replicación,
separan las dos cadenas de la doble hélice original. Las proteínas
de unión a cadena simple estabilizan las cadenas abiertas. La DNA
polimerasa III cataliza la adición de nucleótidos a ambas cadenas
operando sólo en dirección 5' a 3'. Para comenzar a añadir
nucleótidos, esta enzima requiere la presencia de un cebador de RNA,
unido por puentes de hidrógeno a la cadena molde que luego es
reemplazado por nucleótidos de DNA. El cebador de RNA es sintetizado
por la RNA primasa. La cadena adelantada se sintetiza en la dirección
5' a 3' en forma continua. En este caso, el único cebador de RNA
está situado en el origen de replicación, que no es visible en este
esquema. La cadena rezagada también se sintetiza en la dirección 5'
a 3', a pesar de que esta dirección es opuesta a la del movimiento
de la horquilla de replicación. El problema se resuelve mediante la
síntesis discontinua de una serie de fragmentos, los fragmentos de
Okazaki. Cuando un fragmento de Okazaki ha crecido lo suficiente como
para encontrar un cebador de RNA por delante de él, la DNA
polimerasa I reemplaza a los nucleótidos de RNA del cebador con
nucleótidos de DNA. Luego, la DNA ligasa conecta cada fragmento con
el fragmento contiguo recién sintetizado en la cadena.
El
telómero es una secuencia fija y repetida de nucleótidos, presente
en los extremos de los cromosomas lineales de las células
eucariontes. En cada ciclo de replicación los telómeros se acortan,
porque la DNA polimerasa no puede sintetizar DNA desde un extremo
abierto. La enzima telomerasa compensa la pérdida prolongando los
extremos.
Alargamiento
de los extremos de los cromosomas eucariontes por la enzima
telomerasa
(a)
El fragmento de RNA que porta la telomerasa se aparea con los últimos
nucleótidos del telómero.
(b)
La porción proteica de la enzima cataliza la síntesis del DNA
complementario al molde de RNA, elongando de este modo el extremo del
cromosoma.
(c)
La RNA primasa y la DNA polimerasa sintetizan la cadena
complementaria a la sintetizada por la telomerasa. El cebador
sintetizado por la primasa luego es eliminado.
Muchos
errores espontáneos que se producen durante la síntesis del DNA son
reparados de inmediato por la propia DNA polimerasa III. Otros
mecanismos de corrección realizan controles permanentes y reparan
daños en el DNA. Las mutaciones son errores que quedan sin reparar y
se transmiten a las células hijas.
La
energía necesaria para que se produzcan las reacciones catalizadas
por la DNA polimerasa es aportada por los enlaces de los fosfatos que
forman parte de los nucleótidos.
La
DNA polimerasa como herramienta de multiplicación: PCR
La
reacción en cadena de la polimerasa permite multiplicar enormemente
el número de moléculas de DNA de una muestra desconocida de tamaño
ínfimo. Este método consiste en una serie de ciclos de
calentamiento y enfriado que producen la desnaturalización, el
copiado y el reapareamiento in vitro de la molécula de DNA. La
síntesis de DNA es realizada por la Taq DNA polimerasa, una enzima
de origen bacteriano que tolera la temperatura de desnaturalización
del DNA. Esta técnica se utiliza para la detección de enfermedades
hereditarias, identificación de personas, clonado de genes y pruebas
de paternidad.
- La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (llamada Taq DNA polimerasa) y los cuatro desoxirribonucleótidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
-
Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95 ºC, se separan las dos cadenas del DNA molde.
-
La temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.
-
La mezcla se calienta a 72 ºC, temperatura a la cual la DNA polimerasa (Taq) extiende la cadena complementaria a partir del extremo 3' de los cebadores.
-
Al finalizar cada ciclo, la cantidad de DNA molde disponible para el ciclo siguiente (f, g, y h) se duplica.
El
DNA como portador de información
En
el DNA, la información se encuentra en el ordenamiento lineal o
secuencia de las cuatro bases que lo componen. La estructura del DNA
puede dar cuenta de la enorme diversidad de los seres vivos
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